收到细胞后，首次进行培养，应该注意些什么？

收到细胞后最重要的步骤是解冻，但亚洲的客户无需进行此步骤，因为Invivogen将细胞运往亚洲地区时使用的是细胞培养板在常温下运输。收到细胞后需要立马进行传代培养，不要放在-80℃或者液氮中，因为这会损伤细胞。

我在HEK和THP1细胞的初始培养过程中有困难，请问有什么建议可以参考吗？

如果您在初始培养细胞的过程中遇到任何问题，请参考以下的建议：

● 对于前2-3次传代的细胞，应置于含20%胎牛血清且无抗生素的培养基中培养。但此条件下培养细胞时间不宜过长，2-3代之后的细胞应使用含10%胎牛血清的培养基进行培养。

● 请定期检查细胞状态，不要使细胞的汇合度达到100%。

● 当冻存细胞时，请继续培养其他未冻存的细胞，以防冻存细胞有问题。

如果你正在培养THP1细胞，以下是额外需要注意的地方：

● 对于THP1细胞，我们建议细胞浓度在3 x 105 -7 x 105 cells/mL时进行传代，一般为5 x 105 cells/mL。如果低于这个浓度，细胞将需要很长时间才能生长，如果高于2 x 106 cells/mL，则可能会产生毒性。

● 在每次传代之间，请不要使用离心机分离细胞。THP1细胞在条件培养基中生长的会更好，因此当传代时，不要弃去上一代培养细胞时所使用的全部培养基，留1-2 mL，并加入新鲜的培养基。但是原来培养基的占比不能超过50%，因为这样会导致细胞无法获得足够的营养去生长。

为什么要在细胞传代2-3次之后才可加入筛选抗生素？

由于最初的耐药标记物水平较低，细胞对筛选抗生素会更加敏感。因此，建议等待2 - 3代后再添加筛选抗生素，以避免在前几代时对细胞造成进一步的应激。

建议用什么血清来培养InvivoGen的细胞?

建议使用无内毒素的血清来培养报告细胞系。InvivoGen在培养细胞时，会要求供应商提供其所使用血清的COA，以确保低水平的内毒素，以免激活NF-kB通路。

细胞培养基中应添加多少浓度的青霉素或链霉素？

建议使用100 U/mL的青霉素和100 µg/mL链霉素。

如果用于细胞培养的培养基中所含的L-glutamine（L-谷氨酰胺）浓度与说明书中不一致会有问题吗？

没有问题的，只要培养基中L-谷氨酰胺的浓度不低于2 mM就可以。大多数DMEM配方中含有4mM的L-谷氨酰胺，但一般情况下培养基中含有2 mM的L-谷氨酰胺即可维持细胞的正常生长。

细胞培养过程中可以使用谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物GlutaMax吗？

谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物GlutaMax均已通过测试，可以使用，在使用过程中与添加L-谷氨酰胺的细胞相比未发现有任何差异。

为什么推荐使用热灭活的血清培养细胞？

许多InvivoGen的细胞系都是通过SEAP（分泌型胚胎碱性磷酸酶）报告系统进行改造的。在很多情况下胎牛血清（FBS）中含有的微量碱性磷酸酶（AP）会干扰检测结果。因此，为了降低背景干扰，建议使用灭活血清培养Invivogen的所有细胞。

有灭活胎牛血清（FBS）的操作方法吗？

实验室中建议在56℃中加热30分钟来灭活血清。灭活时，需要等水浴温度达到56℃之后再将含血清的试管放入，以确保血清完全灭活。

冷冻培养基必须含有灭活的胎牛血清（FBS）吗？

实验时我们通常使用含灭活胎牛血清（FBS）的冷冻培养基，生长培养基及测试培养基。然而，如果您在冷冻培养基中使用非灭活的血清也是没有问题的。

在培养HEK细胞时没有贴壁，应如何处理呢？

当HEK-Blue™细胞没有贴壁时，要么是开始培养时稀释过度，要么是在培养瓶中融合过度窒息而死。

以下建议可使您在后续培养中避免出现这种问题：

● 改变培养基，在T25培养基中以1.5×10^6 cells/mL培养细胞。

● 建议将细胞转入新的培养瓶之前要清洗细胞。有时细胞难以贴壁是因为活细胞与死细胞聚集成簇。已因此清洗细胞以去除影响细胞贴壁的DMSO。

● 使用含20%胎牛血清（FBS）的培养基培养细胞。

● CellBIND表面细胞培养瓶的使用会促进细胞贴壁及生长，然而，一般的细胞培养过程中不需要使用表面细胞培养瓶。

培养THP1细胞时细胞分裂一次需要一周的时间是正常的吗？

细胞分裂一次需要一周的时间是不正常的。由于细胞克隆的不同，通常情况下THP1细胞分裂一次需要24-72个小时。培养THP1细胞时需保证细胞的浓度大于或等于5 x 105 cells/mL。Invivogen的研发团队已经注意到当稀释过度时会出现死亡。此外，在等待细胞改善的过程中不要添加Normocin™。

如果THP1细胞在生长过程中出现聚集成团但未死亡应该怎么办呢？

只要细胞生长很好，形态正常，细胞抱团生长是没有问题的。因为死细胞的存在可能是导致细胞抱团生长的原因，所以您可以离心去除死细胞。请注意，我们建议您在进行化验前均质细胞。

应如何从活细胞中去除死细胞？

推荐使用120 G转速离心10分钟。

可以提供一些减少HEK-Blue™细胞背景信号的建议吗?

● 为减少实验中的背景信号，需在刺激之前一直NF-kB的活性。

● 实验分析时使用至少传代24小时的健康细胞。

● 确保细胞的汇合度不超过80%。

● 使用预热的PBS清洗细胞。

● 使用灭活的胎牛血清（FBS）培养细胞（清除血清中残留的碱性磷酸酶）。

● 进行细胞刺激之前不要离心。

● 每个孔板中不要加入过多的细胞（推荐每孔中加入大概50000细胞）。

为什么在检测培养基中不推荐加入NormocinTM？可以在检测培养基中添加筛选抗生素吗？

不建议在检测培养基中添加NormocinTM是因为在进行检测时要减少培养基中潜在的干扰因素。因此也不推荐在检测培养基中添加其他筛选抗生素。

当使用数量相同但传代数不同的细胞及浓度相同的配体实验时，可以得到类似的结果吗？

这很难说，因为很难预测传代数对实验结果的影响。但是在我们的实验中使用传代数不同的细胞对实验结果的影响是非常小的。

Invivogen的细胞系可以用于其它实验吗？例如ELISA和Western blotting.

是的，Invivogen的细胞系是可以用于ELISA和Western Blots的。然而，我们没有做过此类验证。

Invivogen的细胞系可以用于定量检测吗？

它们是半定量测试。然而，它们可以通过使用阳性对照制作标准曲线来用于定量测量。

是否可以将刺激后的上清液冷冻，以便日后读取/检测SEAP的产量?

如果您不能立即进行检测实验，可将上清样本储存于4℃，但储存时间不可超过一周。如果需要更长时间的储存，可将其置于-20℃。但在此条件下推荐使用含20%胎牛血清（FBS）的检测培养基，以在冷冻过程中尽量保护SEAP不受损害，请不要重复冻融循环。

如果实验中需要使用抑制剂处理细胞，是用抑制剂单独预处理细胞还是配体与抑制剂共孵育后处理细胞?

这由抑制剂所决定。如果抑制剂阻断了信号通路中的受体或元素，我们建议将抑制剂与细胞预孵育至少30分钟。如果抑制剂结合或阻断配体(即针对特定细胞因子的抗体)，那么最好在添加到细胞之前将抑制剂与配体预孵育。

在刺激之前，细胞需要接种多长时间？

在加入配体时应同时接种细胞（先加配体）。

对于贴壁细胞应该使用什么冷冻培养基？

对于贴壁细胞，推荐使用DMEM，20%(v/v)的胎牛血清（FBS）和10%(v/v)的DMSO。

对于悬浮细胞应该是什么冷冻培养基？

对于悬浮细胞，推荐使用胎牛血清（FBS）和10%的DMSO。

如果冻存步骤未成功，应如何处理？

以防出现类似的问题，Invivogen强烈建议在解冻冻存的细胞之前维持培养细胞培养板中未冻存的细胞处于正常生长状态。

SEAP的产生需要NF -κB和AP-1转录因子的激活，还是仅仅激活一个转录因子就可以得到信号?

Invivogen的报告细胞系仅需要激活一个转录因子（NFκB 和/或 AP-1）就可以得到信号。

Lucia™荧光素酶来自于什么物种?

InvivoGen的荧光素酶是完全合成的，不属于任何天然荧光素酶。

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