该免疫組化实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

所需试剂

• 丙酮

• 乙醇，无水变性的，组织学分级 (100% 和 95%)

• 蒸馏水

• 苏木精

• 二甲苯

• 10X TBS: 制备 1 升10X TBS：24.2g Tris base, 80g NaCl; 用HCl (使用 1X) 将pH 调至 7.6 。

• 洗涤液 TBS/T: 1X TBS, 0.1% Tween-20: 制备 1 升需将100ml 的 10x TBS 加入到 900 ml 双蒸馏水中。加入1ml Tween 20 然后混合。

• 10 mM 柠檬酸钠缓冲液： 制备 1 升需将 2.94g 柠檬酸钠加入到 1 升的蒸馏水中。将 pH 调至 6.0。

• 3% 过氧化氢： 制备需将10ml 30% H₂O₂ 加入到 90ml 蒸馏水中。

• 封闭液: 5% 马血清或山羊血清溶于TBS

• ABC 试剂: 在使用前30分钟根据制造商说明制备。

• DAB 试剂: 根据制造商说明制备。

组织制备

A. 新鲜冷冻切片

组织制备

1. 在液氮中将组织切成小块 (5 mm x 5 mm x 3 mm)。

2. 转移到恒冷箱切片机中, 切成5–30 μm薄的切片，将切片转移至带正电荷的载玻片上 (poly-L-lysine 包被的).

3. 室温下干燥切片 (若当天染色则干燥1-2 小时，直至完全干燥)。注意：彻底干燥才能保证组织恰当地粘附在切片上。

固定方法

可用的固定方法有很多种. 应遵循产品说明书上指定的方法或找到适宜样品的最佳方案。

• 冷丙酮: -20°C处理10分钟。自然干燥。

• 甲醇: -20°C处理10分钟。

• 10% 中性甲醛溶液: 室温下10分钟。

• 3% 甲醛: 室温下15分钟。

• 3% 甲醛/甲醇: 室温下15分钟，然后用甲醇 -20°C处理 5 分钟 (中间不要漂洗)。

用PBS （pH 7.4 含1% Tween 20）漂洗切片3次，每次5分钟。

B. 固定的, 冷冻组织切片

1. 使组织充满固定剂或将组织浸入到固定剂中一段时间。最常用的固定剂是4% 多聚甲醛。

2. 将组织浸没于冻存保护液（其中含有含10-30%蔗糖的PBS）中。当组织沉入溶液中后冻存保护就完成了。

3. 从冻存保护液中取出组织，保存于 -70°C 直到切片。

4. 将组织从 -70°C 冰箱取出，在-20°C平衡15分钟 然后再切片。-20°C平衡帮助避免切片时的断裂。

5. 用恒冷箱切片机将组织切成 10-15um 的切片，收集切片置于载玻片上。通常每个载玻片可以放置3片切片，留出足够间距。

6. 充分干燥切片。可使用自然风干或切片加热器，通常需要过夜或在40-50°C下至少干燥2~3小时。

7. 制好的切片可以干燥保存在 -70°C 直至染色。 在复水染色前要先平衡至室温并适当干燥。

C. 石蜡包埋切片

脱蜡和水化切片

1. 二甲苯：换 2-3 次，每次5分钟。

2. 100% 纯乙醇：换2次，每次3分钟。

3. 95% 乙醇: 换2次，每次3分钟。

4. 80% 乙醇：3分钟。

5. 50% 乙醇：3分钟。

6. 蒸馏水，PBS，或 Tris buffer：换2次，每次3分钟。

注意: 一旦组织切片复水，不要使之干透。用吸水纸吸干组织切片周围。用钻石划针，免疫組化笔，陶瓷记号笔, 或指甲油在载玻片上将切片圈起来。这个圈可以在接下来的孵育过程中使溶液留存于切片上。

抗原修复

很多抗原的可视性可以通过抗原修复来提高，抗原修复可以打破福尔马林固定时形成的蛋白质交联，从而使被掩藏的抗原显现出来。抗原修复技术包括不同时间长度的加热或者利用蛋白酶来做酶消化，例如蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。

加热的方法通常会用到微波炉，高压锅，蒸箱或水浴。将样品在接近100°C高温加热20分钟后再冷却同等的时间。最常用的抗原修复液有 a) 柠檬酸盐缓冲剂, pH 6.0, b) Tris-EDTA, pH 9.0 和 c) EDTA, pH 8.0.

如需要可用柠檬酸盐缓冲剂做抗原修复：

柠檬酸盐缓冲剂配方:

• 10mM 柠檬酸钠, 0.05% Tween-20, pH 6.0 或

• 10mM 柠檬酸, 0.05% Tween-20, pH 6.0

1. 将含有柠檬酸钠或柠檬酸盐缓冲剂的染色盘放到蒸箱或者水浴中，预热到95-100 °C。

2. 将切片浸没于染色盘中。盖子虚掩，孵育20-40 分钟 (研究者需自己决定最佳的孵育时间)。

3. 关掉蒸箱或水浴，将染色盘置于室温下，让切片冷却20分钟。

4. 在TBS-Tween-20中漂洗切片2次，每次2分钟。

5. 开始封闭步骤。

过氧化氢孵育

阻断内源性过氧化物酶 (如需要):

1.将切片浸入到 0.3-3% H2O2 和 100% 甲醇中，室温下10-30 分钟。

2.在蒸馏水中漂洗切片，换2次，每次5分钟。

免疫组化实验方案

封闭步骤:

1. 用3-10% 来自二抗宿主物种的正常血清孵育切片30分钟，以阻断非特异的抗体结合。

2. 移去封闭液。

一抗孵育

*所有步骤需在湿润的环境中进行。

1. 在封闭液中稀释一抗。如果没有建议的稀释度，从 1:10, 1:100 和 1:1000开始。

2. 4°C 孵育过夜。

3. 移去抗体溶液。用PBS，pH 7.4 洗涤3次，每次5分钟。

4. 如果一抗是HRP-标记的，直接开始显色步骤。

二抗孵育

1. 根据建议的稀释度在封闭液中稀释生物素-标记的二抗。室温下孵育 30-60 分钟。

2. 移去二抗溶液。在洗涤液中清洗3次，每次5分钟。

显色

1. 向每个切片中加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶试剂，室温下孵育30分钟。

2. 移去 ABC 试剂。用洗涤液清洗切片3次，每次5分钟。

3. 在湿润的环境下用 DAB 溶液彻底覆盖切片。室温下孵育 5-15 分钟。或者，在显微镜下观察切片来决定最佳的不溶沉淀物颜色深度。

4. 一旦显色，用蒸馏水小心冲洗以终止反应。

5. 如需要可以用苏木精和曙红对组织进行复染色。

6. 用蒸馏水清洗切片。

复水以及加盖玻片

1. 样品复水：使用一系列不同浓度的甲醇或乙醇- 50% (2 x 5 min), 75% (2 x 5 min), 最后 100% (2 x 5 min)。

2. 用二甲苯重复上述步骤，孵育切片两次，每次10秒钟。

3. 使切片自然干燥。

4. 用合适的固定介质固定好盖玻片。

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