E. Collagen

胶原

因为去糖基化的胶原会影响关节炎的产生（11），同时一些未去除的杂质比如：胃蛋白酶可能会导致T 细胞刺激试验中产生假阳性（12），因此二型胶原应按规定高度纯化。如果按恰当的方法冻干的胶原-20℃避光保存的条件下，是非常稳定的。纯化的胶原溶于0.05M 浓度的醋酸中，终浓度为2-4mg/ml，温和搅拌，4℃过夜。胶原溶液可在4℃保存一周，此后需在-20℃保存。

Chondrex 公司提供较完整的不同免疫级别二型胶原. 比如，DBA/1小鼠对鸡或者牛的二型胶原蛋白有较强的免疫反应，然后C57B/6 小鼠只对鸡的二型胶原蛋白有免疫反应。

A. Preparing the Emulsion

乳剂单位制备

乳剂的质量对于诱发关节炎至关重要。乳剂的制备有多种方法。但是不推荐双注射器或超声波处理的方法。这些方法将导致乳剂不能够有效的、稳定的诱发关节炎。此外，超声处理方法，至少将胶原分成 2 个片段，这些小片段在正常体温下，很容易变性。

推荐使用电动的高速搅拌器：

1.用高速搅拌器 (图一)（带直径≤5mm 的刀片，图二a）搅拌完全佐剂CFA (或用于增强剂注射的不完全佐剂（IFA）)和胶原溶液 将注射器尖端用三通阀封闭 (图二b)。把注射器夹紧，固定在铁架台上，并冰浴 (图三)。最后一步很重要，因在搅拌过程中会发热，会引起蛋白变性，变性的蛋白不能够诱发关节炎（CIA）。

(图一 高速搅拌器)

（图二 (a) 搅拌器刀片-直径0.5cm, (b)带三通阀的注射器，（c）玻璃注射器）

（图三 带三通阀的注射器固定在支架上，冰浴）

2.加 1 体积（最多不超过注射器的25%）完全佐剂（不完全佐剂在加强免疫时用到）到注射器，再缓慢加入等体积的胶原溶液（0.05M 醋酸溶解的的胶原溶液，终浓度为 2mg/ml），边低速搅拌（1000-3000rpm）边滴入胶原溶液。

注：为保证高质量的免疫乳剂，一次量乳剂体积应不得超过注射器体积的50%。如果需要多量生产，可重复以上步骤。

3.继续高速混合（10,000 – 30,000rpm）2分钟。冷却5分钟，再重复高速混合和冷却步骤2-3次直到产生稳定的乳液。对于大体积乳剂制作（2-5ml）为了是乳液混合均匀，建议在混匀过程中上下移动搅拌刀片。

4.用针头替换三通阀，在装有冰水的烧杯里滴一滴乳剂，检测乳剂的稳定性。如果乳剂是稳定的，如图所示（图四），在水中是成团的，不散开。如果乳剂在水中散开，表明乳剂不稳定，再加几滴佐剂，重新混合再次进行测试。

（Figure 4 - 图四 完整稳定的乳剂漂浮在水面）

5.将乳剂转移到1ml的玻璃注射器 （图二C）.不建议采用塑料注射器，因为很难做到一个准确的注射剂量。

注：1.通过用力甩注射器将乳剂中的气泡赶出注射器（活塞部向下）。否则很难做到一个精确的注射剂量。

        2.建议在乳剂制备好的一小时内完成注射。乳剂在使用之前存放在4°C。

B. Injection Site

免疫注射部位

在鼠尾根部皮下注射 0.1ml乳剂(100μg胶原每只老鼠（图五）。例如：从尾根部 2cm 处插入针头（25号或者27号针头，长度5/8英尺，针插入皮下，针头沿斜向上与鼠尾方向平行插入，直到针尖插入位置距尾根部0.5cm。每次注射前充分擦拭针头，防止乳液的露出。

如果要加强免疫，注射部位在尾根部 3cm 处，针尖插入皮下距鼠尾根部1.5cm处。加强免疫的注射部位应避开初始注射部位）。

注: Chondrex公司不建议使用背部皮下注射注射或腹腔注射胶原乳剂和佐剂，因为乳剂会引起腹腔和胸腔严重的炎症反应。

（图五 皮下注射乳剂）

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