✍背景有黑点，怎么办？➨详情信息 1、封闭液未溶完全
解决：
A.确认BSA/牛奶有完全溶解，建议增加溶解时间或溶解后取上清液使用。
B.利用0.45um滤纸过滤溶液，也可使用商品化试剂，如GTX30964（Trident Universal Protein Blocking Reagent，适用于WB、IHC、ICC/IF、ELISA）。
C.改变缓冲液，如换为BSA。
2、溶液污染
解决：
使用现配的溶液（Running/transfer/blocking/wash buffers）或商业化溶液减少因长菌长霉造成的黑点。
3、封闭液及抗体交互作用 解决：
一般脱脂牛奶中含有casein这种磷酸蛋白，可能会与磷酸化抗体产生非特异性结合。因此，如使用磷酸化抗体，建议用BSA作为封闭溶液，同时洗脱溶液也用TBST，如此可降低黑点高背景的情况。 |
✍过曝，怎么办？➨详情信息
1、蛋白样品过量
解决：
降低蛋白上样量，通常蛋白上样量为30-50ug，但有些蛋白表达量较高（如β-actin），此时可依蛋白表达量，进行微调。
2、抗体过量
解决：
A.增加抗体稀释倍数。
B.减少孵育时间，一般孵育时间为37℃，1小时。
C.于4℃过夜孵育，减少抗体非特异性结合。
3、讯号过曝
解决：
A.缩短曝光时间。
B.使用低灵敏的ECL。 |
✍拖带，怎么办？➨详情信息
1、样品不纯，有杂质污染
解决：
A.重新离心样品，取上清液使用。
B.使用较纯的试剂配制细胞裂解液或购买商业化产品。
C.使用Benzonase®核酸酶，Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白样品粘度，减少核酸对跑胶的干扰。
D.全细胞或亚细胞萃取，使用商业化全细胞或亚细胞萃取试剂盒提取蛋白样品，减少配制试剂溶液以及操作中分离不干净的问题。
2、蛋白样品过量
解决：
A.降低蛋白上样量，通常蛋白上样量为30-50ug，但有些蛋白表达量较高(如beta actin)，此时可依蛋白表达量，进行微调。
B.蛋白变性不完全，也会使条带成团拖曳；此时，可通过延长样品加热时间(一般约5分钟)及调整SDS(一般是2 %)比例，使蛋白变性更完全。
3、讯号过曝
解决：
A.缩短曝光时间。
B.使用低灵敏的ECL。 |
✍条带扭曲，怎么办？➨详情信息
1、胶没配好
解决：
A.确保APS＆TEMED正常，并新鲜配制胶体。
B.空的泳道加Sample Buffer
2、电流电压问题
解决：
避免胶体过热。电压过高也会出现微笑、歪斜条带等条带，建议上层浓缩胶使用80V；下层分离胶使用100-120V。另外也需检查电泳槽是否有锈蚀造成电流不稳。过热时可改为在冷室或者冰浴中进行电泳。
3、转膜问题
解决：
小心滚压胶体并确保与膜贴合，有时出现 2个条带是因为转膜时不小心移动到膜产生叠影。 |
✍高背景，怎么办？➨详情信息
1、封闭问题
解决：
A.确认封闭完全。封闭作用不足，这是其中一种可能的原因，提高封闭物浓度可确保封闭液完全覆盖转印膜，如使用5% 脱脂奶粉或BSA。
B.封闭液不与抗体反应。这种情况较常发生在磷酸化抗体的使用过程中，由于牛奶含有casein这种磷酸蛋白，因此如果使用牛奶当封闭液，封闭液与磷酸化抗体可能会产生非特异性的结合。这个情况下，建议使用BSA作为封闭液，同时搭配使用TBST的洗脱液来帮助降低高背景值的状况。
C.封闭时间增加，一般情况会使用室温37度封闭1小时，可视情况调整封闭的条件。
2、膜的问题
解决：
A.选择合适的膜（可参考详情信息）
B.膜干掉，建议整个实验过程都须注意让膜保持湿润，特别是PVDF膜。
C.膜没有完全均匀湿透，PVDF膜较会出现这个状况，使用PVDF膜前，需用100% methanol完全浸润膜。
3、抗体问题
解决：
A.降低抗体浓度
B.以阳性对照确认二抗
C.足够的洗脱时间和次数
4、呈色问题
解决：
ECL呈色问题造成高背景值的原因，可能是因为化学显色底物过多；建议按说明书加入适量的显色底物。 |
✍非特异性条带，怎么办？➨详情信息
1、蛋白降解
解决：
A.加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，避免蛋白降解。
B.冰上操作。
C.避免反复冻融样品（建议分装）；建议使用新鲜制备的样品。
2、蛋白形成多聚体 解决：
A.使用现配的DTT/2-ME并将加热时间延长，帮助打断多聚体的双硫键。
B.样本煮沸温度达到95℃-100℃。
3、确认蛋白特性
解决：
查询生物信息是否有后修饰、剪切体等。
4、抗体浓度过高/蛋白样品过量
解决：
A.增加抗体稀释倍数，也可调整孵育时间，并在4℃孵育。
B.减少上样量。
5、抗体非特异性结合
解决：
A.增加洗膜次数与时间或在洗涤液里改用不同强度的detergent或是增加浓度。
B.设对照组来确认抗体非专一性结合可能的原因，例如：是否有目标蛋白表达。
6、抗体检测到heavy/light chain的信号
解决：
这种情况通常发生在IP实验里，GeneTex有一系列可避免辨认heavy/light chain的特制二抗，其设计原理是用来辨认native的一抗结构。（可参考详情信息） |
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